Сюжет

40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II.^[15] Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью на своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году, когда Эцио после разговора с Минервой бежит из Рима вместе со своим дядей Марио Аудиторе. После, фамильная резиденция рода Аудиторе — Монтериджони (итал. Monteriggioni) осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын Родриго Чезаре Борджиа. В осаде, на глазах у Эцио, погибает его родной дядя Марио.^[16] После этого действие игры переносится в 1500 год, где Эцио вынужден организовать и начать развивать «подполье» (в которое входят Римские воры, куртизанки, а далее и рекруты-ассасины), когда начинает возрождаться орден, лидером которого формально был Николло Макиавелли, который после передаёт титул Эцио. На протяжении игры Эцио пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание.

В будущем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они должны пройти подземные туннели и устроить укрытие в Святилище под виллой Аудиторе для того, чтобы найти Яблоко Эдема и остановить надвигающуюся катастрофу.

Сам же Эцио при помощи Бартоломео, Ла Вольпе и Клаудии узнаёт что Яблоко Эдема было передано на изучение учёному, Катерина Сфорца будет в замке Сант-Анджело на следующей неделе а Чезаре в замке с Папой. Кроме того Ла Вольпе сообщает что Макиавелли - предатель и даже показывает его встречу с солдатами Борджиа. Но, доверяя Макиавелли Эцио просит Ла Вольпе не делать поспешных выводов. После Эцио проникает в замок и спасает Катерину но Чезаре не убивает. Наконец Эцио решает начать создать Братство Ассасинов. Тем же вечером с Эцио встречается Леонардо Да Винчи. Сообщив что Яблоко у него отняли, он решает помочь Эцио с оружием. А также сообщает обо всех планах и его постройках для армии Чезаре. С помощью сенатора Эцио узнаёт где находится кардинал Хуан Борджиа, он же банкир. С его смертью Чезаре лишается средств на войну. Затем Эцио и Бартоломео хитростью убивают барона Де Валуа. Наконец Эцио спасает жизнь актёру Пьетро, который в тайне от Чезаре встречается с Лукрецией. Разузнавший Чезаре приказал отравить его, но Эцио его спасает и взамен получает ключ от запасного входа в замок Сант-Анджело. Тем же вечером Эцио встречает вора с повязкой на правом глазу, того самого который участвовал во время битвы за Монтериджони. Выясняется что предатель - он, а не Макиавелли. Эцио убивает предателя и находит Ла Вольпе, который уже почти собирается убить Макиавелли, и сообщает о том что узнал, предоставив письмо, которое он взял у вора.

В 1506 году Чезаре сбежал из плена в Кастилии и в 1507 началась война в Виане. Пройдя поле битвы, Эцио побеждает Чезаре и сбрасывает с обрыва со словами: "Я передаю тебя в руки судьбы". После Эцио оставляет Яблоко Эдема под Колезеем в Риме.

В настоящем, из воспоминаний Эцио становится ясно, что тот спрятал яблоко Эдема под Колизеем в Риме. Команда отправляется туда, чтобы забрать яблоко, они проходят катакомбы, и находят искомое. Как только Дезмонд взял в руки яблоко, оно овладело им и заставило ударить Люси скрытым клинком в область живота. Оба они падают без сознания. После, два неизвестных находят героев и подключают Дезмонда к «Анимусу», так как тот был в состоянии сильнейшего шока, а спасти его можно было только так. В конце дополнения «The Da Vinci Disappearance» из разговора незнакомцев становится ясно, что одного из них зовут Уильям (вероятно, тот, с которым переписывалась Люси), а Дезмонд впал в кому.